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谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF

Catalog No.： S6150H

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Storage Condition： 2～8℃

Shelf Life： 1年

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Catalog No.	Specification	List Price	Preferential Price	VIP	Beijing	Harbin	Shenyang	Guangzhou	Quantity	Cart
S6150H	10ml	$254.56

Product Name

Introduction：

谷胱甘肽琼脂糖凝胶4FF
pGEX系列表达载体表达的融合蛋白与谷胱甘肽S-转移酶结合，因此可以使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶填料进行纯化。pGEX是一类以谷胱甘肽（γ-谷胱甘肽半胱胺酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和层析填料纯化GST融合蛋白的效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。
1 性能参数：

基质	4%的交联琼脂糖凝胶
配体密度	120-300 umol谷胱甘肽/g填料
吸附载量	5-10 mg谷胱甘肽-S-转移酶/ml填料
介质颗粒大小	45-165μm
最大流速	100 cm/h
pH范围	3-12
化学稳定性	0.1 M NaOH
保存温度	+4-8℃
保存液体	20%乙醇

*检测条件：层析柱16mm×200mm *柱床高5cm，25℃
2 使用
2.1 缓冲液制备
所有缓冲液需要用0.45um的过滤器过滤。常用下面的缓冲液，适用于大部分GST融合蛋白：
结合缓冲液：PBS，pH 7.3
洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0
2.2 样品制备
在将样品上样之前，应将样品用0.45um过滤器进行过滤或离心。如果样品太粘稠，应用结合缓冲液稀释，以防止堵塞色谱柱。
2.3 柱纯化
2.3.1 装柱
（1）让所有的材料和试剂均平衡至层析实验的温度。配制缓冲液，对所有的缓冲液进行脱气处理。
（2）检查层析柱所有部件，特别是过滤网，密封圈，螺旋塞是否紧密，玻璃管是否干净和完整。
（3）根据需要量取相应量的凝胶，用去离子水清洗掉20%乙醇。
（4）将柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位，务必使底端无气泡。
（5）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
（6）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定（注意压力不要超过填料最大耐压）。
2.3.2 平衡色谱柱
用5-10个柱体积的结合缓冲液平衡该柱，直到流出液电导和pH不变。
2.3.3 上样
（1）样品用平衡液配制，样品一定要离心或过滤后上样。盐浓度太大的样品需要处理后再上样。
（2）一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质和没有结合的蛋白，再选择一种洗脱液洗下目标产品。
2.3.4 洗脱
洗脱缓冲液使用阶梯梯度或线性梯度洗脱。对于洗脱步骤，5个柱体积的洗脱缓冲液通常就足够了。对于线性梯度洗脱，适当增加洗脱步骤。
注意：
影响GST标记蛋白或其他谷胱甘肽结合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖4FF结合的最重要的参数之一是流速。由于GST和谷胱甘肽之间的相对较慢的结合动力学，重要的是在样品使用期间保持低流速以获得最大结合能力。蛋白质特性，pH和温度是可能影响结合能力的其他因素。
用于洗脱的体积和时间可随标记的蛋白质而变化。可能需要更高浓度的谷胱甘肽的额外洗脱。如果需要，应使用SDS-PAGE与Western印迹组合监测洗涤和洗脱物质中的GST融合蛋白。
GST标记的蛋白质的浓度也可以通过标准显色方法（例如Lowry，BCA和Bradford测定）来测定。
2.4 手动简易纯化
1）确定纯化所需的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF的体积。注意：谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF保存在20％乙醇中。
2）轻轻摇动谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF的瓶子，使填料混合均匀，转移到合适的离心管中。
3）500×g离心5分钟沉淀谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF。小心倒去上清液。
4）通过向每1ml浆液中加入5ml结合缓冲液来洗涤谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF。
5）500×g离心5分钟沉淀填料，小心倒去上清液。
6）再次重复步骤4和5，反复3-5次。
7）将样品加入到平衡好的的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF中并孵育至少30分钟。
8）使用移液管或量筒将混合物转移到合适的容器/管中。
9）500×g离心5分钟沉淀填料，小心地倒出上清液并保存，以用于测量与填料的结合率，做SDS-PAGE。
10）通过向每1ml浆液中加入5ml结合缓冲液来洗涤谷胱甘肽琼脂糖凝胶4FF。反转混合。
11）500×g离心5分钟沉淀填料，小心倒出上清液并保存，以用于SDS-PAGE分析。
12）重复步骤10和11两次，共洗涤三次。
13）通过每1ml谷胱甘肽琼脂糖4FF浆液加入0.5ml洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，在室温下孵育5-10分钟。反转混合。
14）500×g离心5分钟沉淀填料，小心倒出上清液并保存。
15）重复步骤13和14两次，共洗脱三次，根据结果分别检查三种洗脱物纯化的蛋白质。
3 在位清洗
如果填料似乎失去结合能力，则可能是由于沉淀，变性或非特异性结合蛋白的积累。
去除沉淀或变性物质：用2倍柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后立即用5倍柱体积的PBS（pH7.3）洗涤。
4 保存
4-8℃密闭保存。使用完的填料，用纯水彻底冲洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。
5 注意事项：
（1）上样之前，样品必须经过膜过滤及去除色素，否则杂质及色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。所有的缓冲液均需要用0.45um的过滤器过滤。
（2）在使用过程中，避免使用高浓度的强酸强碱，酸和碱的浓度应低于0.1摩尔。碱会使流速变慢。
（3）不同的样品，吸附和洗脱方法不相同，可以根据相关的文献进行。

These protocols are for reference only. Biotopped does not independently validate these methods.

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