Na⁺K⁺- ATP酶活性测定说明书
微量法
货号：TOPEK190899
规格：100管/48样
产品简介：
Na⁺K⁺- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。
自备的仪器和用品：
酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容：
提取液：液体100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6ml蒸馏水充分混匀待用；用不完的4℃保存一周。
试剂三：液体 2ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂七：液体25ml×1瓶，室温保存。
试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液 1mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂八 20倍稀释，即取 0.1mL试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H2O:试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：

1. 细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

1. 血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤：
分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。

1. 酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

	对照管	测定管
试剂一（μL）	65	45
试剂二（μL）	60	60
试剂三（μL）		20
样本（μL）		100

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

试剂四（μL）	25	25
样本（μL）	100

混匀，8000g，常温离心10min，取上清液

1. 定磷(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂)

	空白管	标准管	对照管	测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）		20
上清液（μL）			20	20
蒸馏水（μL）	20
定磷试剂（μL）	200	200	200	200

混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。
注意：

1. 由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测48份Na⁺K⁺-ATP酶。
2. 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3. 空白管和标准管只要做一管。

计算： 
1.血清（浆）Na⁺K⁺- ATPase活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= （C标准管×V总）×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
2.组织、细菌或细胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的计算：
a.按蛋白浓度计算：定义：规定每小时每毫克组织蛋白中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/mg)= C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷（Cpr×V样）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
b.按样本鲜重计算：定义：规定每小时每克组织中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
 
Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g)= C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷(V样÷V样总×W)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
3.按细菌或细胞密度计算：定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/10⁴)= C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷(V样÷V样总×500)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.1mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。